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选择合适的定量PCR仪方法
点击次数:41 发布时间:2019-05-02

定量PCR仪主要由两部分组成,一个是PCR系统,一个是荧光检测系统。选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的,对于定量PCR系统来说,重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等,更重要的还在于样品孔之间的均一性,以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统,多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多,仪器适用的荧光素种类越多,仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光,仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品,通道越多,仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源,前者可配多色滤光镜实现不同激发波长,而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长,不过因为是单色,需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管,前者可以一次对多点成像,后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品,需要通过逐个扫描实现多样品检测,对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计,这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。——随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用,市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新。

1. 传统的96孔板式定量PCR仪
传统的96孔板式定量PCR仪以美国应用生物系统公司(ABI)为代表。传统96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材,可以采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应,但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效应(可参考生物通龙虎榜:PCR仪的选择一文),因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致,样本和样本之间的温度控制也可能存在差异,对于灵敏度极高的定量PCR来说,任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大,不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大,温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢,因而反应速度也较慢。96孔板定量PCR仪的荧光检测分析系统,由于96孔板上样品孔的位置是固定的,每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同,有可能对结果产生影响。检测在试管管底进行,试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。MJ和Bio-Red公司的定量PCR仪也属于这一类。

ABI的7500型荧光定量PCR仪激发光源为卤钨灯光源,5色滤光镜,可同时激发96个样品,超低温CCD具备同时多点多色检测的能力,能够有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量,可以大大提高精度并节约成本。随机配置的定量PCR引物和探针设计软件Primer Express非常有用,“因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针”。 各型号都有实时动态(Real-Time)和终点读板(Plate Read)两种运行模式。实时动态模式用于定量DNA或RNA拷贝数。可以动态显示PCR扩增曲线的生成,定量的线性范围大于9个数量级,区分5000和10000个拷贝的DNA模板可信度达99.7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性(SNP)分析等。当然,也可以作为普通PCR仪使用。ABI定量PCR仪最大的优势在于ABI已经发布十二万种Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒,覆盖人类全部4万个基因,二百万种Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因组SNP检测试剂盒,为运用7000、7300、7500、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。ABI 的定量PCR仪均支持两种定量化学:TaqMan荧光探针和SYBR Green I荧光染料。其熔解曲线(Dissociation Curve)功能用于判断PCR扩增反应是否特异,有无杂带生成。7500型号比7300多一个滤光镜,新的光路设计使长波长红色荧光的检测灵敏度大大提高,带有快速运行模式。增强的7900型在96孔模块的基础上更加可以更换384孔版模块,使得高通量处理数据的能力大大增强,应该更适合经常处理大量标本的实验室。

MJ的Option系列是在MJ原来的常规PCR仪基础上改造,采用LED光源PMT光电倍增管荧光检测器。 96个单色LED光源对应96孔板,但是单色LED激发波长范围较窄。Option是单道单个光电倍增管荧光检测器,升级的Option2是双PMT光电倍增管荧光检测器,PMT灵敏度高但一次只能扫描一个样品,所以Option系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。双PMT可同时进行双色检测(FAM/SYBR Green I;VIC/Joe/TAMRA)。优势之一是带梯度功能。Bio-Rad(伯乐)也算是个熟悉的品牌,iCycler iQ实时定量PCR系统也是96孔平板式固定加热的,荧光检测波长范围400-700nm,可4波长同时检测,仪器的设计灵活,定性和定量部分可独立工作,同样可完成梯度PCR。5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。技术intensifier荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。MJ被Bio-Rad收购后,Option和iCycler iQ目前还是各自走各自的销售渠道,至于将来Bio-Rad会如何决定二者的发展方向还需要拭目以待。

2.创新概念的离心式实时定量pcr仪
为了克服平板式定量pcr温度均一性差的缺点,聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量pcr仪,以roche罗氏的lightcycle和corbett的rotor-gene为代表。pcr扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样,借助空气加热和转子在腔内旋转,转子上每个孔都是“等位”的,几乎无差别,很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题——corbett的rotor-gene样品间温度差异小于±0.01℃地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触,接触面积大且加热均匀。虽然有竞争对手批评空气介质比热小,但事实上roche的lightcycle%202.0却是目前升温速度最快的定量pcr仪,可以达到20℃/秒!Corbett的Rotor-gene也可以达到5℃/秒(样品实际升温速度达到2.5℃/秒),优于多数的平板式PCR仪。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖;还可以将酶加在管盖上,升温后离心到管底与反应体系混合,实现“机械的热启动功能”。由于升温速度快,对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应,Roche的LightCycler仅需20—30分钟即可完成,可以大大节约时间和提高工作效率。这一点对于研究人员来说极为有用,因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了,或者换句话来说,2个多小时你可以做4—5轮定量实验了。

联系人:巴小姐

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