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Nanodrop One与Qubit 4的区别
点击次数:126 发布时间:2019-01-04

凡是需要做分子生物学实验的lab,肯定逃不了要买一台核酸定量的机器。目前流行的仪器是Nanodrop One,只需滴加一两微升的样品,按一下按钮,利用核酸的紫外吸收特性,即可得到浓度数据。近几年,以Qubit 4为代表的基于特异荧光染料法的仪器也逐渐进入科研人员的视野。那么,这两类仪器有什么区别,在使用时需要注意什么,如何根据实验室需求来选购?且听老司机分解。

首先我们需要来理解两台仪器在核酸定量原理上的区别。正如方才所言,Nanodrop One利用了核酸的紫外吸收特性。

(图1:Nanodrop One)

核酸,包括DNA和RNA,均由核糖、磷酸基以及碱基构成。其中,由于碱基含有芳香环结构,因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波长为260 nm。根据朗伯比尔定律,已知物质的消光系数(几十年前早已测量),液层的厚度(固定的样品室),就能利用其吸光度来计算出物质的浓度。与此同时,还能通过计算A260/A280和A260/A230的数值,估计核酸的纯度。(280 nm吸光通常来自蛋白质,而230 nm则通常来自糖类和苯酚等。)

而Qubit 4这一类仪器采用的是荧光染料法。这些荧光染料可以特异地与不同种类的核酸链相结合,并在特定波长光源的激发下,发出荧光。其中,结合了核酸的荧光染料,相比那些游离的,信号可增幅数十倍至数百倍,因此可以和背景区分开来。目前,做测序的实验室基本把Qubit 4当标配仪器了。

(图2:Qubit 4.0)

虽然以Nanodrop One为代表的紫外吸收法在科研领域已经沿用了数十年,但由于原理上的限制,这一类仪器有无法避免的缺陷。

1、紫外吸收法无法区分DNA和RNA

这一点其实在原理上就很好理解了。如下图所示,具有紫外吸收的结构是核酸的碱基,而DNA和RNA均含有碱基,因此当一份样品同时含有DNA和RNA的时候,无论你本意是想测哪一个,均会高估其真实浓度。

(图3:核酸的结构)

而Qubit 4的荧光染料法则避免了这个问题。只要采用DNA、RNA特异的染料,就能有选择性地测定样品中的核酸浓度。下图是Qubit 4的测试数据。这个实验是在DNA样品中混合入不同比例的RNA,并用Qubit 法和紫外吸收法分别进行测定。当DNA的样品足够纯时(DNA:RNA = 10:0),两种方法测得的数值并没有显著区别。但当混入的RNA越来越多,紫外吸收的数值也跟着升高(蓝色和绿色柱子),而使用双链DNA染料的Qubit数值则没有改变(红色柱子)。使用RNA染料用Qubit 4进行测定,则会发现,随着RNA混入的增加,读数也跟着升高。

(图4:Qubit和紫外吸收法对DNA-RNA混合样品的测定)

目前,双链和单链DNA、RNA及蛋白质均有特异的荧光染料。也就是说,无需专门纯化样品,或者在未知污染程度的情况下,使用Qubit可以方便地得知浓度信息。

2、紫外吸收法的定量限较高

记得有一次做实验,放了0.5 µg质粒做酶切,跑胶回收于30 µl的溶液中,然后做Nanodrop测定浓度,后数值约为25 ng/µl……

于是本司机得到的结论是:我们实验室的那台Nanodrop一定是内置了贤者之石(雾——) 还是去隔壁借用一下Qubit吧。

其实是这样的,对于任何仪器分析,我们都应该去理解其检出限和定量限。Nanodrop标称的检出限是2 ng/µl(双链DNA),然而定量限则远高于此。其他的Nanodrop one用户也有类似的体验,曾经在ResearchGate上看到说,低于50 ng/µl的话就容易测不准,变异度会增大。以下同样是来自Qubit的数据。当DNA的浓度低于某个程度时,紫外吸收法的偏差和变异度就突破天际了。

(图5:Qubit与紫外吸收法测定低浓度DNA时的偏差及变异度比较)

这两张图中,紫外吸收法得到的偏差和变异度在我看来已经算小的了(不能搞太大啊,不然没人买怎么办?数据来自Thermo Fisher公司,但他们家两类仪器都有,手心手背都是肉),要低于4 ng/µl双链DNA才会乱飙车。然而在实际使用中,低于10甚至20 ng/µl时就比较容易出乱子。而PCR产物胶回收等应用,终的实际浓度往往就落在这个容易测不准的范围内。虽然这对老司机们来说还不至于把下游实验搞砸,但测不准还是很郁闷的。

3、紫外吸收法对溶液的pH和盐浓度敏感

在研究物质吸光度时,我们总要明确地定义缓冲液的离子强度以及pH,这就说明,吸光度本身是受到这两个因素影响的。

通常而言,偏酸的溶液,容易给出偏低的A260/A280数值。相反,偏碱的溶液则容易高估。相应地,也有报道称,当用水作为溶剂时,紫外吸收测定的数值变异度增大,而当使用Tris或Tris-EDTA溶液进行测定时,重复性就提高了。这其中的原因,很可能是空气中溶解入水中的CO2浓度差异造成的。离子强度对于紫外吸收的影响比较复杂,这里不展开。

相比之下,荧光染料法对样品的污染和pH等的容忍度较大。

4、紫外吸收法对降解比较严重的核酸无能为力

这一点,同样也是由紫外吸收原理的局限性所决定的。紫外吸收测定的对象是碱基,因此无论核酸是完整成链的,还是降解成单个游离核苷酸,该方法均无法加以区分。尽管我们可以通过A260/A280数值是否过大来估计核酸样品的降解状况,但却无法选择性地只测定那些结构完整的核酸的浓度。

而荧光染料通常结合的是核酸的链结构,并不会与游离的单核苷酸相互作用。不过话说回来,对于那些尚未降解成单个核苷酸而呈短链状态的核酸,荧光染料法是无法将其与完整核酸区分开来的。

[咚咚咚!敲黑板!]

但是,紫外吸收法也不是一味的烂,荧光染料法也不是说吊打(大面积吊打还是做得到)。

如果在实验中获得的核酸样品总是很纯净且均一(如原材料是容易对付的培养细胞,还用品质好的试剂盒进行抽提;而非奇奇怪怪的极端样品,还要是自己配的试剂),同时产量又很高,那紫外吸收法完全可以胜任,外加测定速度荧光染料法。此外,荧光染料法对温度比较敏感,比如上一回是在25℃室温制作并储存的标准曲线,而这一回要测定样品时实验室空调坏掉,一下子有了3℃以上的温差,那么标曲就得重新制作。同时,荧光染料要现用现配,样品至少要染2 min,花费的时间比紫外吸收法要长。

以下用一张表总结两者的优劣。请根据自己的实际情况斟酌。

联系人:巴小姐

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